Заморожування і тривале зберігання сперми бика

Широке застосування знайшов метод заморожування і тривалого зберігання сперми бугаїв в рідкому азоті (-196 °). Заморожену сперму можна доставляти в господарства 1-2 рази на рік і використовувати її в міру потреби. Один раз на місяць судини, в яких міститься сперма, необхідно поповнювати рідким азотом. На племпідприємства (станціях) зі штучного осіменіння сільськогосподарських тварин сперму заморожують за допомогою спеціального обладнання (приладів, апаратів і т. д.) і зберігають у стаціонарних ємкостях, що знаходяться в сховищах станцій (філій). Звідси її відправляють в обслуговувані господарства. Для заморожування сперми на племпідприємства (станціях) застосовують такі методи. Метод двухмоментно розбавлення і трехступенчатого режиму заморожування сперми бугаїв за допомогою спеціальних апаратів (АХК-4, ПЗСС та ін.) До заморожування допускають сперму з рухливістю сперміїв не нижче 8 балів і їх концентрацією не менше 0,8 млрд. в 1 мл. Потім сперму розбавляють глюкозо-цитратно-желточной середовищем (35-37 °) двухмоментно: спочатку без гліперіна, а через 4 години після охолодження до розбавленої сперми шляхом подслаіванія додають таку ж середовище, що має температуру плюс 2-5 ° і містить 16% гліцерину. Сперму в гліцерінізірованной середовищі витримують в побутовому холодильнику 6-12 год при температурі 2-5 ° Після еквілібраціі (урівноваження) перевіряють рухливість сперміїв (вона повинна бути не нижче 7 балів), розфасовують у скляні або поліетиленові ампули по 1-1,2 мл. Ампули запаюють і вкладають в ємності, які поміщають в апарати для заморожування. Заморожують сперму за триступеневою режиму з наступною швидкістю: від 0 до 15 ° по 0.5-Г в 1 хв, від 15 до 50 ° по 2-3 ° в 1 хв і від 50 до 80 ° по 5-7 ° в 1 хв, після чого ємності (каністри) переносять в рідкий азот для зберігання.

Перед осіменінням ампулу зі спермою відтають у ванні з водою температурою 38-40 ° протягом 45-60 с. Рухливість сперміїв після відтавання повинна бути не нижче 4 балів. Метод одномоментного розведення і швидкого заморожування сперми у формі гранул. В якості розріджувачів використовують синтетичні середовища № 1 і 2. До розріджувача додають нетоксичний стрептоміцин з розрахунку 1 г на 1000 мл рідини. Свежеполученную сперму (після оцінки) розбавляють середовищем № 1 у відношенні 1:1, при цьому концентрація гліцерину в розведеною спермі буде 3,5%, якщо якість сперми дозволяє, її додатково розбавляють середовищем № 2. При визначенні ступеня розбавлення сперми для заморожування враховують, що в одній гранулі об'ємом 0,1 мл після відтавання повинно міститися не менше 20-25 млн. рухливих сперміїв. Після розведення сперму вміщують у ванночку з водою, температура якої дорівнює температурі сперми, і переносять на 30 хв у холодильник. При цьому стежать, щоб сперма і вода охолоджувалися не швидше 1 ° на хвилину. Потім сперму при температурі 5 ° еквілібріруют протягом 5-5 ч. Для приготування гранул беруть блок сухого льоду (двоокис вуглецю) і на його поверхні спеціальним нагрівальним приладом (до електропраски прикріплюється пластина з виступами) роблять лунки діаметром 5-7 мм. У кожну лунку 2-міліметровим шприцом вносять по дві краплі сперми. Величина гранул повинна бути 0,1 мл.

Після 5-10-хвилинної витримки на поверхні сухого льоду гранули висипають у посудину (кухоль) з рідким азотом. Гранули зі спермою різних биків висипають в окремі ємності. Сперму биків (заморожену) в гранулах можна розфасовувати в спеціальні трубочки з білої жерсті з подовжнім розрізом або в алюмінієві туби, на яких записують спеціальним олівцем кличку бика, дату отримання сперми і назва племпідприємства (станції). У господарствах для відтавання гранул використовують спеціальний розчин (на 100 мл дистильованої води 2,9 г лимоннокислого натрію для ін'єкцій, 0,1 г лимонної кислоти), що поставляється централізовано в спеціальних ампулах по 1 мл. Одна гранула розчиняється у вмісті однієї ампули. Крім заморожування сперми на сухому льоду, в даний час широке застосування знайшов метод заморожування сперми у формі гранул в рідкому азоті за допомогою спеціальних пластин.

Заморожування сперми в гранулах в рідкому азоті на фторопластових пластинах. Після отримання та оцінки сперму биків розбавляють лактозо-желточной середовищем з гліцерином наступного складу: вода дистильована - 100 мл, лактоза - 11,5 г, жовток курячих яєць -20 мл, гліцерин -5 мл. Для попередження розвитку мікрофлори в спермі до середовища додають препарат спермосан-3. Перед розведенням середу підігрівають до 30-35 °. Цією середовищем сперму биків розбавляють в 2, 10 разів і більше, залежно від обсягу гранул. Якщо застосовують концентровані гранули сперми обсягом по 0,1 - 0,2 мл, то для них потрібні менші ступеня розведенні. На пункті штучного осіменіння гранули сперми по 0,1-0,2 мл додатково розбавляють. Для цього їх перед заплідненням корів відтають у флаконі з 1 мл 2,9%-ного розчину лимоннокислого натрію, підігрітого до температури 38-40 °. Для заморожування сперми у гранулах об'ємом 0,5-1,0 мл сперму розбавляють в 10 разів і більше. Такі гранули перед заплідненням корів не вимагають додаткового розведення. Якщо гранули об'ємом 0,5 мл, то перед заплідненням корів беруть дві гранули, поміщають їх у стерильний флакон або пробірку і занурюють у теплу воду (38-40 °) для відтавання.

Для заморожування сперму після розбавлення охолоджують до температури 2-4 ° протягом 4-5 год, а потім розливають градуйованими піпетками, шприцом або розливної машиною в лунки (0,1-0,2 або 0,5 мл) охолодженої в рідкому азоті фторопластовою пластини. Пластину зі спермою витримують над поверхнею рідкого азоту на відстані 5-10 см протягом 1,5-2 хв, а потім занурюють їх у рідкий азот на 1-2 хв. Після заморожування сперми пластину виймають з рідкого азоту, гранули сперми збирають в сачок або контейнер, а потім пересипають їх у охолоджені чашки. На пунктах штучного осіменіння гранули сперми зберігають у посудинах Дьюара. Рівень азоту в них повинен бути значно вище чашок із замороженою спермою в гранулах. Перед осіменінням гранули сперми з чашок дістають охолодженим до -196 ° пінцетом, відтають їх, виробляють Оцінку активності сперміїв і використовують для осіменіння корів при активності сперміїв не нижче 4 балів. Предметне скло кладуть на столик мікроскопа, нагрівають сперму до температури 40 ° в термостаті або на обігрівальне столику і визначають рухливість сперміїв. Для подальшого зберігання допускається сперма, що має рухливість сперміїв не нижче 4 балів. Метод заморожування сперми в облицьованих гранулах. За цим методом для заморожування використовують свежеполученную сперму, розбавлену середовищами, "° 1 н № 2 такого складу.

Середа № 1. 11%-ний розчин лактози або сахарози 63 мл
Жовток курячих яєць 30 мл
Гліцерин 7 мл

Середа № 2. Вода дистильована 100 мл
Лактоза або сахароза 6 г
Натрій лимоннокислий тризаміщені пятіводний1, 4 г
Гліцерин 5 мл

Приготовлені середовища наливають у стерильні поліетиленові ємності по 200-400 мл, які приєднують до спеціального пристрою для розведення сперми. Після отримання сперми її розбавляють середовищем № 1 в співвідношенні 1: 1 і витримують при кімнатній температурі 5-10 хв. Потім проводять додаткове розбавлення сперми середовищем № 2 до необхідної концентрації (20-25 млн. в дозі). Сперму розбавляють за допомогою спеціального пристрою, що дозволяє дозування вводити середовища в відокремлену частину одноразового поліетиленового спермоприймача зі спермою. Спермоприймача з'єднують з тонкостінної полімерної трубкою і видавлюють в неї розведену сперму. Заповнену спермою трубку розділяють з допомогою автомата АРС-2 на окремі дози по 0,33 мл з їх герметизацією. Облицьовані (герметизовані) гранули поміщають в алюмінієві контейнери, які закривають пробками. Контейнери закріплюють в обойми спеціального пристрою для еквілібраціі і заморожування сперми. Це пристрій поміщають в холодильник для охолодження до 2-5 °. Після 5-6-годинної витримки при такій температурі обойму апарату з контейнерами занурюють в ємності з рідким азотом на 8-10 хв.

Активність сперміїв після заморожування сперми перевіряють через 24 п. З кожного контейнера беруть по одній гранулі і опускають у воду з температурою 40 ° для відтавання. Гранулу витирають марлевою серветкою, за допомогою ножиць її розкривають і визначають активність сперміїв. Для подальшого зберігання допускають сперму з активністю не нижче 4 балів. Для заморожування сперми в необлицьовані гранулах її після охолодження і еквілібраціі накапують на фторопластову пластину безпосередньо яз спермоприймача.

Заморожування сперми в соломинках (пайеттах). При заморожуванні використовують поліпропіленові або полівінілхлоридні трубочки довжиною 100 мм з внутрішнім діаметром 2,4 мм, один кінець яких попередньо закривають спеціальним герметизуючим складом: парафін ГОСТ 13577-12,0, пентаерітрітовий ефір каніфолі - 44,8 , тальк - 10,1, каучук натуральний - 1,5, гліцерин ГОСТ 6259-71-8,0, барвник - 0,1. Сперму розбавляють трісбуферной середовищем, що містить 6,056 г трісбуфера (трісгідрооксіметіламн-нометан), 3,4 г лимонної кислоти, 2,5 г фруктози, 166,3 мл бидистиллированной води. Розчин ділять на дві рівні частини, до першої додають 15,8 мл бидистиллированной води, 25 мл свіжого яєчного жовтка, 100 тис. ОД антибіотиків, до другої-19,7 мл гліцерину, жовток і антибіотики в тих же кількостях. Перший розріджувач додають до еякуляту, попередньо доведеному до температури 25 °. Другу середу повільно додають до попередньо розведеної спермі з таким розрахунком, щоб у соломинку (пайетте) містилося 20-25 млн. рухливих сперміїв. Після розведення сперму розфасовують по 0,4 мл в стерильних умовах вакуумним способом. Для цього необхідна кількість промаркованих соломинок (від 100 до 500 шт. Залежно від кількості сперми) ставлять відкритими кінцями вниз в скляну плоскодонну посуд зі спермою в поміщають в анаеростат, з якого насосом спочатку відкачують повітря до тиску 0,95 атм., А потім впускають його.

Повітря нагнітає сперму в соломинку. Заповнені спермою пайетти затискають в спеціальному утримувачі, при температурі 25 ° занурюють в герметизуючий склад і закривають другий кінець. Після герметизації соломинки поміщають на мідне сито (кошик) і переносять в пари рідкого азоту стаціонарного сховища. Кошик із соломинками опускають в сховищі до зіткнення з поверхнею азоту. Скипання азоту утворює струм холодного газу, який охолоджує і заморожує сперму до 100-130 ° протягом 5 хв. Соломинки із замороженою спермою переносять в стаканчики, поміщають в каністри і закладають у сховище з рідким азотом. Заморожену в соломинках сперму перед використанням розморожують в стерильному поліетиленовому мішечку, вміщеному в теплу воду (38-40 °) протягом 12-14 с. Незалежно від методу заморожування сперму розтає й перевіряють на рухливість сперміїв відразу після заморожування, другий раз - через добу, третій - через 7-10 днів і четвертий раз - через 14-20 днів. Заморожена сперма для подальшого зберігання допускається при рухливості сперміїв не нижче 4 балів. Для оцінки відталої сперми в пайеттах (вибірково) виробляють змішування її з однієї соломинки з рівною кількістю ізотонічного розчину лимоннокислого або бікарбонату натрію. Для цього один кінець соломинки обрізають ножицями і опускають у розчин, а потім цими ж ножицями обрізають і другий її кінець. Отриману суміш сперми і розчину перемішують соломинкою і з її допомогою беруть краплю для оцінки. Для осіменіння використовують сперму не раніше 14-20 днів після заморожування. Відталу сперму знову заморожувати не можна. Для оцінки сперми, що зберігалася при температурі 2-4 °, краплю сперми наносять на предметне скло і поряд з нею наносять краплю 2,9%-ного розчину лимоннокислого натрію або 1%-ного розчину бікарбонату натрію, потім обидві краплі, не змішуючи, закривають покривним склом.

Техніка безпеки при роботі з судинами Дьюара
При роботі з рідким азотом треба закривати незахищені ділянки тіла, оскільки він викликає обмороження. Працювати слід в захисних окулярах або щитках з органічного скла, на руки одягати брезентові (азбестові, шкіряні) рукавиці або рукавички. Незахищений ділянку тіла, на який потрапив рідкий азот, швидко обливають водою.
При заливанні рідким азотом неохолодженого судини не можна заглядати в горловину судини, тому що при цьому може статися викид рідкого азоту внаслідок утворення великої кількості газу.
Підвищення концентрації азоту в повітрі викликає головний біль, запаморочення і втрату свідомості. Тому приміщення, де зберігають рідкий азот, обладнують припливно-витяжною вентиляцією. При непритомному стані потерпілого негайно виносять на свіже повітря.
Не можна щільно закривати судини Дьюара. При транспортуванні судин з азотом їх слід добре фіксувати. При перевезенні автотранспортом судини заливають наполовину гідравлічної ємності. Щоб уникнути вибуху судини відігрівають в ізольованому приміщенні.
Для запобігання накопичення вибухонебезпечної суміші в ємності вміст кисню слід контролювати за допомогою переносного газоаналізатора ГХП-3: в сховищах-1 раз на рік, на пунктах-1 раз на 6 місяців. Після накопичення кисню в кількості 15% посудину необхідно спорожнити в місці, очищеному від предметів органічного походження: дерева, паперу, ганчір'я (особливо промаслених), гною і пр.